ABSTRAK
Percobaan isolasi dan karakterisasi DNA bertujuan untuk memperoleh dan menentukan sifat-sifat (karakter) umum molekul DNA. Sampel yang digunakan adalah strawberry. Prinsip dari percobaan ini adalah perusakan sel ekstrak dari strawberry secara mekanik dan kimiawi agar terjadi pemecahan sel dan karakterisasi dengan pengamatan kelarutan, penentuan panjang gelombang maksimum dan terjadinya denaturasi dan renaturasi dengan penambahan detergen. Metode yang digunakan adalah metode spektofotometri, yaitu pengukuran panjang gelombang maksimum. Untuk karakteristik DNA diperoleh hasil yaitu DNA dapat larut dalam aquadest. Untuk menentukan sifat-sifat DNA, yaitu denaturasi dan renaturasi dilakukan dengan pengukuran absorbansi pellet DNA dengan penambahan asam yaitu HCl. Sedangkan dalam penentuan karakteristik dari DNA menggunakan variasi pelarut, yaitu aquadest, kloroform, eter, dan n-heksan. Dari percobaan ini diperoleh hasil pellet DNA larut baik dalam aquadest, dan larut tak sempurna dalam etanol, tetapi tidak larut dalam kloroform, eter, dan n-heksan. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang maximum sebesar 345 nm. Dari percobaan diperoleh hasil yaitu nilai absorbansi pada masing – masing pelarut sebelum di tambahkan HCl adalah dengan pelarut akuades 0.357 nm, etanol 0.049 nm, kloroform 0.024 nm, eter 0.022 nm dan n-heksan 0.005 nm. Sedangkan nilai absorbansi setelah penambahan HCl adalah dengan pelarut akuades 0.369 nm, etanol 0.049 nm, kloroform 0.046 nm, eter 0.047 nm dan n-heksan 0.028 nm.
PERCOBAAN VII
ISOLASI DAN KARAKTERISASI DNA
I. TUJUAN PERCOBAAN
Untuk memperoleh dan menentukan sifat-sifat (karakter) umum molekul DNA
II. DASAR TEORI
2.1 DNA
Asam deosiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA, adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyususn berat kering setiap organisme. DNA umumnya terdapat di dalam sel.
DNA merupakan suatu polimer , rekombinasi DNA merupakan suatu proses alamiah denagn unsur-unsur material genetik (pecahan-pecahan molekul DNA) dipersatukan ke dalam suatu molekul DNA yang lain. DNA produk dirujuk sebagai suatu DNA rekombinan.
(Fessenden, 1986)
DNA merupakan molekul yang amat panjang, terdiri dari ribuan deoksiribosa nukleotida yang tergabung dalam suatu urutan yang bersifat khas bagi setiap organisme. Molekul ini biasanya berbentuk rantai ganda. Kromosom sel eukariotik merupakan satu molekul besar DNA yang berikatan erat menjadi suatu daerah inti atau nukleotida. Sel eukariotik mengandung sejumlah molekul DNA. Masing-masing pada umumnya memiliki ukuran jauh lebih besar daripada sel prokariota.molekul DNA dalam eukariota bergabung dengan molekul protein dan dikelompokan menjadi serabut kromatin di dalam nucleus, yang dikelilingi sistem ganda yang kompleks.
DNA berfungsi untuk menyimpan informasi genetik seacra lengkap yang diperlukan untuk menentukan struktur semua protein dari tiap-tiap spesies organisme agar biosintesis sel dan jaringan berlangsung secara teratur, untuk menentukan aktivitas organisme sepanjang siklus hidupnya dan untuk menentukan kekhususan organisme tertentu.
(Lehningher, 1982)
2.2 Sifat-sifat DNA
Beberapa sifat penting DNA adalah :
1. Mengabsorpsi sinar ultraviolet pada panjang gelombang 260 nm
2. Menunjukan roatsi optis yang kuat
3. Dalam larutan menunjukan viskositas yang tingi katena struktur heliksnya yang kokoh
4. Mengalami denaturasi akibat adanya pemanasan atau agitasi akibat pemecahan ikatan hidrogen, pendinginan memperbaki ikatan hidrogen antara pasangan-pasangan basa.
5. Ikatan hidrogen dapat dipecah dalam pH asam atau basa.
(Hart, 1963)
2.3 Struktur DNA
Struktur asam nukleat dapat diketahui lebih terinci lagi. Gugus hidroksi 3’ dari ribose terikat pada hidroksil 5’ dan ribose berikutnya melalui ikatan fosfodiester. Tentu saja basa heterosiklik dihubungkan dengan unit deoksiribosa oleh ikatan N-glikosida. Perlu dicatat bahwa pada DNA tidak ada lagi gugus hidroksil unit eoksiribosa yang tersisa. Pada setiap fosfat masih mempunyai satu proton bersifat asam yang biasanya mengion pada pH 7. Jika proton ada, zat tersebut adalah suatu asam, karena itulah bernama asam nukleat. Adapun strukturnya adalah sebagai berikut:
(Hart, 1963)
2.4 Struktur Skunder DNA
Sejak tahun 1938 telah diketahui bahwa molekul DNA mempunyai bentuk tertentu, karena hasil sinar-x pada analisis DNA menunjukan pola teratur secara berkala. Penelitian pada tahun 1950 menunjukan hal-hal penting mengenai struktur DNA. Chargaff menganalisis kandungan baa DNA dari berbagai organisme dan ia menemukan bahwa komposisinya selalu sama. Ketika dilakukan penelitian di Cambridge University ditunjukan sifat-sifat DNA heliks.
Ciri-ciri penting DNA heliks :
1. DNA terdiri dari dua rantai polinukleotida yang melingkar menurut satu sumbu heliks
2. Kedua sumbu heliks bersifat putar kanan dan arahnya berlawanan menurut ujung-ujung 3’ dan 5’ nya
3. Basa purin dan pirimidin terletak di dalam heliks pada bidang yang tegak lurus sumbu heliks, sedang gugus-gugus deoksiribosa dan fosfat terletak di bagian luar heliks
4. Kedua rantai mempunyai pasangan basa purin dan pirimidin dihubungkan oleh ikatan hidrogen, adenine selalu berpasangan dengan timin dan guanin selalu berpasangan dengan sitosin
5. Tidak ada pembatasan pada urutan basa di epanjang rantai polinukleotida, urutan yang pasti menentukan informasi genetik.
(Lehningher, 1982)
Tulang belakang molekul DNA adalah suatu rantai panjang yang terdiri dari molekul gula deoksiribosa yang diikat menjadi satu oleh gugus-gugus fosfat. Satu ujung rantai mempunyai satu gugus OH pada karbon lima, menurut penomoran gula, ujung yang lain mempunyai satu gugus OH pada karbon nomor 3’.
Tiap molekul gula dalam DNA juga dihubungkan ke satu molekul cincin heterosiklik, yang biasa dirujuk sebagai basa. Hanya empat basa utama yang terdapat dalam DNA. Dua sari basa ini adalah pirimidin tersubstitusi dan dua lagi adalah purin tersubstitusi.
(Fessenden, 1986)
2.5 Isolasi DNA
Proses isolasi DNA diawali dngan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan secara hati-hati agar tidak merusak DNA yang diisolasi. Untuk mengeluarkan DNA dari sel dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti sel baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan pemblenderan atau menggerus dengan mortar, sedangkan cara kimiawi dapat dilakukan dengan senyawa yang dapat merusak membran sel dan membran inti, salah satunya adalah detergen.
Penambahan detergen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena detergen dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk detergen dengan protein-protein kompleks. Ikatan tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofobik, demikian juga dengan detergen sehinga dapat membentuk suatu ikatan kimia.
(Mahmud, 2006)
2.6 Replikasi DNA
Setiap kali sel membelah diri, maka sel harus membuat satu unit lengkap dari seluruh gen yang dimilikinya. Produk pembelahan yaitu dua sel anak masing-masing menerima satu komplemen dari informasi ekologi yang dimiliki indomnya. Oleh karena itu proses pembelahan sel melibatkan replikasi DNA yang baru.
Para ahli biologis, hingga awal 1950-an masih belum memahami keseluruhan dari proses replikasi DNA. Tiga strategi yang mungkin bisa jadi ditemukan:
1. Replikasi Semi Konservatif, dimana masing-masing molekul akan mengandung satu polinukleutida dari molekul asli yang induk dan satu nukleotida baru hasil sintesis.
2. Replikasi Konservatif, dimana satu anak mengandung beberapa polinukleotida induk dan anak lain mengandung 2 polinukleutida baru.
3. Replikasi Dispersif, dimana masing-masing rantai nukleutida dari tiap molekul cincin tersusun atas bagian nukleutida induk dan bagian dari polinukleutida baru.
(Lehninger, 1982)
2.7 Denaturasi dan Renaturasi DNA
Dua buah pita nukleotida yang berbentuk double heliks pada molekul DNA dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang sangat lunak. Jika suatu larutan yang mengandung DNA dipanaskan atau dibubuhi alkali yang kuat, maka ikatan hidrogen ini menjadi labil dan putus lalu pita spiral dari molekul DNA itu terbuka. Proses ini dinamakan denaturasi DNA. Jika larutan tersebut kemudian didinginkan kembali, atau dinetralisir secara perlahan-lahan maka terbentuk pasangan-pasangan basa itu kembali. Peristiwa kembalinya ikatan hidrogen antar basa tersebut dinamakan renaturasi. (Surya, 1989)
2.8 Sentrifugasi
Sentrifugasi merupakan suatu teknik pemisahan yang dilakukan berdasarkan sifat partikel dalam medan gaya sentrifugal. Partikel yang berbeda dalam berat jenis, ukuran dan bentuk akan mengendap searah dengan arah gaya sentrifugal yaitu arah jari-jari ke luar (menjauhi sumbu). Untuk partikel yang akan dipisahkan biasanya disuspensikan dalam medium cairyang dimasukan dalam tabung sentrifugal dan ditempatkan dalam motor yang berputar. Rotor terdapat pada pusat sumbu simetri. (Wirahadikusumah, 1989)
2.9 Salting Out dan salting in
Salting Out adalah metode untuk memisahkan protein berdasarkan prinsip bahwa protein kurang terlarut di tinggi garam konsentrasi. Konsentrasi garam yang diperlukan untuk protein untuk mempercepat keluar dari solusi berbeda dari protein terhadap protein. Proses ini juga digunakan untuk berkonsentrasi mencairkan solusi dari protein. Dialisis dapat digunakan untuk menghilangkan garam jika diperlukan.
Salting In ialah peningkatan dalam kelarutan (seperti yang diamati untuk beberapa protein ) oleh larutan encer garam (dibandingkan dengan air yang murni).
(Hart,1963)
2.10 Hidrofobik dan Hidrofilik
Ada hidrofobik asam amino dan hidrofilik asam amino dalam protein molekul. Setelah pelipatan protein dalam larutan air, asam amino hidrofobik biasanya membentuk kawasan lindung hidrofobik sementara asam amino hidrofilik berinteraksi dengan molekul solvasi dan memungkinkan protein untuk membentuk ikatan hidrogen dengan molekul-molekul air di sekitarnya. Jika cukup permukaan hidrofilik protein, protein dapat dilarutkan dalam air.
Ketika konsentrasi garam meningkat, beberapa dari molekul air tertarik oleh ion garam, yang mengurangi jumlah molekul air yang tersedia untuk berinteraksi dengan bagian dibebankan protein. Sebagai akibat dari meningkatnya permintaan molekul pelarut, interaksi protein-protein lebih kuat daripada interaksi pelarut-zat terlarut; molekul protein mengental dengan membentuk hidrofobik interaksi satu sama lain. Proses ini dikenal sebagai pengasinan keluar.
(Fessenden, 1986)
2.11 Presipitasi
Presipitasi merupakan peristiwa jatuhnya cairan (dapat berbentuk cair atau beku) dari atmosphere ke permukaan bumi.
a. Presipitasi cair dapat berupa hujan dan embun
b. Presipitasi beku dapat berupa salju dan hujan es.
Ketika uap air mengembang, mendingin dan kemudian berkondensasi, biasanya pada partikel-partikel debu kecil di udara. Ketika kondensasi terjadi uap air dapat berubah menjadi cair kembali atau langsung berubah menjadi padat(es, salju, hujan batu (hail)). Partikel-partikel air ini kemudian berkumpul dan membentuk awan.Proses terjadinya :
• Penguapan air dari tubuh air permukaan maupun vegetasi akibat sinar matahari atau suhu yang tinggi.
• Pergerakan uap air di atmosfer akibat perbedaan tekanan uap air.
• Uap air bergerak dari tekanan uap air besar ke kecil.
(Fessenden, 1986)
2.12 Strawberry
Buah khas strawberri berasal dari Amerika dan dikembangbiakan dengan baik di daerah Amerika Utara untuk jenis Fragaria virginiana yang terkenal akan rasanya dan Amerika Selatan, Chile untuk jenis Fragaria chiloensis untuk ukuran besarnya.
Berikut adalah Scientific Clasification dari buah strawberry
Beberapa manfaat buah strawberry yang telah diketahui adalah untuk menyusutkan kadar kolesterol, membantu melumpuhkan kerja aktif kanker karena asam ellagic yang dikandungnya, meredam gejala stroke, mengandung zat anti alergi dan anti radang, kaya akan vitamin C yang bermanfaat bagi pertumbuhan anak, hanya sedikit mengandung gula sehingga cocok bagi pengidap diabetes, jika dimakan secara teratur dapat menghaluskan kulit dan membuat warna kulit terlihat lebih cerah dan bersih, dan mencegah terjadinya keriput, dapat dijadikan sebagai pemutih gigi, dengan menghancurkannya kemudian di tempelkan pada gigi selama satu atau dua menit, kemudian gosok dengan sikat gigi secara menyeluruh, ampuh melawan encok dan radang sendi, zat astringent yang terdapat di daun strawberri berkhasiat untuk menghentikan serangan diare, caranya dengan meminum tiga hingga empat cangkir air hasil rebusan daun strawberri.
(Anonim, 2012)
Adapun komposisi kimia buah strawberry dapat dilihat pada tabel berikut:
2.13 Nanas
Nanas berasal dari Brasilia (Amerika Selatan) di kawasan lembah Sungai Parana, Paraguay. Bangsa Indian diduga melakukan seleksi dari berbagai jenis nenas sehingga diperoleh jenis Ananas comosus yang enak dimakan dan sekarang dibudidayakan secara luas diseluruh dunia. Beberapa kultivar nenas berbeda dalam ukuran tanaman, ukuran buah, warna dan rasa daging buah, serta ada atau tidaknya duri pada daun. Kultivar-kultivar tersebut tersebar keseluruh wilayah sehingga memiliki nama yang berbeda-beda. Buah nenas yang mempunyai arti komersial adalah Smooth Cayenne, Queen, Spanish dan Abacaxi. Tanaman nenas merupakan famili Bromeliaceae atau bromeliad. Famili ini terdiri atas 45 genus dan 2000 spesies. Secara sistematis tanaman nenas diklasifikasikan sebagai berikut :
Buah nanas kaya akan enzim bromelain. Yang berguna untuk melegakan tenggorokan dan membantu pencernaan. Enzim bromelain mencerna protein di dalam makanan dan menyiapkannya agar mudah untuk diserap oleh tubuh. Nanas juga dapat digunakan untuk mengempukkan daging. Selain kegunaan di atas. Nanas mengandung citric dan malic acid yang memberi rasa manis dan asam pada buahnya. Asam ini membuat nanas menjadi bahan makanan yang digunakan secara luas untuk membuat masakan asam manis. Bromelin membantu penyembuhan luka dan mengurangi pembengkakan atau peradangan di dalam tubuh. (Chandra, 2007)
2.14 Enzim Bromelin
Menurut Hartadi (1980) bromelin merupakan salah satu jenis enzim protease yang mampu menghidrolisis ikatan peptida pada protein atau polipeptida menjadi molekul yang lebih kecil yaitu asam amino. Bromelin banyak digunakan dalam bidang industri pangan maupun nonpangan seperti industri daging kalengan, minuman bir dan lain-lain. Bromelin dapat diperoleh dari tanaman nanas baik dari tangkai, kulit, daun, buah, maupun batang dalam jumlah yang berbeda. Dilaporkan bahwa kandungan enzim bromelin lebih banyak terdapat pada batang yang selama ini kurang dimanfaatkan. Distribusi bromelin pada batang nanas tidak merata dan tergantung pada umur tanaman. Kandungan bromelin pada jaringan yang umurnya belum tua terutama yang bergetah sangat sedikit sekali bahkan kadang-kadang tidak ada sama sekali. Sedangkan bagian tengah batang mengandung bromelin lebih banyak dibandingkan dengan bagian tepinya.
(Hart,1963)
2.15 Enzim Protease
Enzim protease merupakan enzim yang dapat memecah dinding sel untuk menghasilkan DNA. Enzim protease dapat digunakan sebagai pelembut daging bagi daging yang liat supaya mudah dikunyah, dan membantu menanggalkan kulit ikan dalam industri pengetinan ikan.Enzim exolite yang termasuk dalam kelompok enzim protease ini juga digunakan di industri penyamakan kulit.
(Hart,1963)
2.16 Analisa Bahan
2.16.1 Eter
Sifat Fisik : Titik leleh -116,3oC, Titik didih 34,6oC
Sifat Kimia: Senyawa yang relative lembam (inert), biasanya tidak bereaksi dengan asam encer ataupun basa encer, digunakan sebagai pelarut organik. (Hart, 2003)
2.16.2 NaCl
Sifat Fisik: Padatan kristalin putih. Densitas 2,17, titik leleh 801oC, Titik didih 1413oC
Sifat Kimia: Larut dalam air dan sedikit larut dalam etanol, dijumpai sebagai mineral dalam air laut
(Daintith, 1994)
2.16.3 Heksana
Sifat Fisik: Rumus molekul C6H14, didapat dari fraksi minyak bumi yang ringan pada titik 69oC, Densitas 0,66
Sifat Kimia: Banyak digunakan sebagai pelarut, merupakan pelarut non polar.
(Arsyad, 2000)
2.16.4 Akuadest
Sifat Fisik: Cairan tak berwarna, tak berasa dan tak berbau, berat molekul 12,016gr/mol, Indeks bias 1,332, Titik leleh 0oC, titik didih 100oC.
Sifat Kimia: Bersifat Polar, digunakan sebagai pelarut universal. (Basri, 1996)
2.16.5 Sifat Fisik: Larutan tidak berwarna, rumus molekul C2H5OH, berat molekul 46.0414 gr/mol, titik leleh -114.1, titik didih 78, densitas 1.59.
Sifat Kimia: Larut dalam air, stabil dibawah suhu normal dan tekanan.
(Basri, 1996)
2.16.6 Deterjen
Detergen adalah campuran berbagai bahan, yang digunakan untuk membantu pembersihan dan terbuat dari bahan-bahan turunan minyak bumi. Dibanding dengan sabun, detergen mempunyai keunggulan antara lain mempunyai daya cuci yang lebih baik serta tidak terpengaruh oleh kesadahan air. Dalam Percobaan, deterjen ini biasa digunakan sebagai inhibitor
(Anonim, 2010)
2.16.7 Strawberry (Sumber DNA)
Strawberry memiliki cukup banyak sumber DNA, yang mana sebagai anti radikal bebas. Hal ini ditunjukkan oleh beberapa manfaat buah strawberry yang telah diketahui adalah untuk menyusutkan kadar kolesterol, membantu melumpuhkan kerja aktif kanker karena asam ellagic yang dikandungnya, meredam gejala stroke, mengandung zat anti alergi dan anti radang, kaya akan vitamin C yang bermanfaat bagi pertumbuhan anak, hanya sedikit mengandung gula sehingga cocok bagi pengidap diabetes, jika dimakan secara teratur dapat menghaluskan kulit dan membuat warna kulit terlihat lebih cerah dan bersih, dan mencegah terjadinya keriput, dapat dijadikan sebagai pemutih gigi.
(Anonim, 2012)
2.16.8 Bromelin
Bromelin merupakan salah satu jenis enzim protease yang mampu menghidrolisis ikatan trawbe pada protein atau polipeptida menjadi molekul yang lebih kecil yaitu asam amino.
(Hartadi, 1980)
III. METODE PERCOBAAN
3.1. Alat dan bahan
3.1.1 Alat
Pisau Mesin blender Rak tabung Kertas saring Gelas bekker Spatula Gelas Ukur Batang pengaduk Tabung reaksi
3.1.2 Bahan
Sampel DNA (Strawberri) Etanol Garam dapur Ekstrak Bromelin (Nanas) Detergen Akuades Eter Kloroform heksan
IV. DATA PENGAMATAN
No
|
Perlakuan
|
Hasil
|
1
2
|
Isolasi DNA
dengan metode sederhana
- Pemasukan
detergen dan 56 mL akuades kedalam gelas beker
- Pengadukan
selama 15 menit
- Penimbangan 100g buah strawberry,10g buah nanas dan1g
Nacl
- Pencucian
buah strawberry dan nanas dengan akuades
- Pemasukan
100g buah strawberry dan 10g buah nanas kedalam blender
- Penambahan 1g
NaCl dan 200 mL akuades
- Pemblenderan
selama 10 menit
- Pemasukan 4mL
jus sampel dan 4mL larutan detergen kedalam erlenmeyer
- Pengadukan
selama 10 menit, Penyaringan
- Pemasukan
filtrat kedalam tabung reaksi
- Penambahan 9
mL etanol,Pengamatan
- Pengambilan
pellet DNA
Karakterisasi
DNA
- Pelarutan pellet DNA dalam berbagai pelarut: akuades,
etanol, eter, n-heksan dan kloroform
- Penentuan λ maks dan nilai absorbansi
- Penambahan
HCl dan pengamatan proses
denaturasi DNA
- Penentuan λ maks dan nilai absorbansi
|
Larutan berwarna agak biru dan berbusa
Larutan berwarna merah muda dan berbusa
Larutan berwarna merah muda bening
Terbentuk gumpalan bergelembung (DNA)
DNA larut sempurna dalam akuades
DNA tidak larut sempurna dalam etanol
DNA tidak larut dalam eter, n-heksan dan
kloroform
λ
maks : 345 nm
nilai absorbansi pada pelarut
akuades 0.357 nm
etanol
0.049 nm
eter
0.022 nm
n-heksan
0.005 nm
kloroform 0.024 nm
DNA terdenaturasi
λ maks : 345 nm
nilai absorbansi pada tiap pelarut
akuades
0.369 nm
etanol
0.049 nm
eter 0.047 nm
n-heksan
0.028 nm
kloroform 0.046 nm
|
V. HIPOTESA
Dalam percobaan Isolasi dan Karakterisasi DNA ini bertujuan, unutk memperoleh dan menentukan sifat – sifat (karakter) umum molekul DNA. Sampel yang digunakan adalah buah strawberri dan nanas. Pada percobaan ini mempunyai prinsip, yakni perusakan sel ekstrak dari daun bawang secara mekanik dan kimiawi agar terjadi penglisisan sel dan karakterisasi dengan pengamatan kelarutan, penentuan panjang gelombang maksimum dan terjadinya denaturasi dan renaturasi. Sedangkan metode yang digunakan dalam percobaan ini adalah penglisisan sel dengan cara mekanik yaitu dengan pemblenderan dan secara kimiawi dengan penambahan detergen. Dari percobaan ini diprediksikan akan diperoleh DNA dari sampel strawberri dengan menmbahkan etanol 96%, dan juga akan dilakukan karakterisasi dari DNA yang sudah dihasilkan dengan identifikasi berupa Pelarutan, pengukuran panjang gelombang, dan denaturasi. Pada pelarutan akan diprediksikan bahwa pelarutan terhadap pelarut polar DNA yang dihasilkan akan larut semua, sedangkan pada pelarut non polar tidak larut. Untuk menentukan sifat-sifat DNA, yaitu denaturasi dan renaturasi dilakukan dengan pengukuran absorbansi pellet DNA pada berbagai variasi suhu . Pada pengukuran panjang gelombang akan dihasilkan panjang gelombang maksimal berkisar lebih dari 260 nm. Pada denaturasi dengan melakukan pemanasan diprediksikan berupa penurunan nilai absorbansi jika dibandingkan pada kondisi normal, yakni dari percobaan diperoleh hasil yaitu nilai absorbansi semakin meningkat dengan meningkatnya suhu.
VI. PEMBAHASAN
Percobaan isolasi dan karakterisasi DNA bertujuan untuk memperoleh dan menentukan sifat-sifat (karakter) umum molekul DNA. Sampel yang digunakan adalah strawberry. Prinsip dari percobaan ini adalah perusakan sel ekstrak dari strawberry secara mekanik dan kimiawi agar terjadi pemecahan sel dan karakterisasi dengan pengamatan kelarutan, penentuan panjang gelombang maksimum dan terjadinya denaturasi (suatu perubahan atau modifikasi terhadap struktur sekunder, tersier, dan kuarterner molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan – ikatan kovalen) dan renaturasi (proses pembentukan kembali struktur untai ganda dari keadaan terdenaturasi) dengan penambahan Sabun. Metode yang digunakan adalah metode spektofotometri, yaitu pengukuran panjang gelombang maksimum.
DNA merupakan master molekul (molekul utama) yang mengandung semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. Asam ini adalah asam polimer yang terdiri dari molekul-molekul deoksiribosanukleat yang terikat satu dengan yang lain, sehingga membentuk rantai polinukleotida yang panjang. Molekul DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan phosphat yang membentuk suatu nukleotida.
Basa purin yang terdapat dalam DNA adalah adenin dan guanin sedangkan basa pirimidin yang terdapat dalam DNA adalah sitosin dan timin. Antara basa-basa yang terdapat pada rantai asam nukleat ini terikat dengan suatu ikatan hidrogen. Adenin dapat membentuk dua ikatan hidrogen dengan timin (A=T), sedangkan Guanin dan sitosin dapat membentuk tiga ikatan hidrogen (G C).
Ikatan yang terbentuk antara basa-basa tersebut dapat dilihat dari struktur berikut:
Molekul DNA yang panjang itu terbentuk oleh ikatan antara atom C nomor 3 dengan atom nomor 5 pada molekul deoksiribosa dengan perantaraan gugus phosphat. DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu molekul DNA juga dapat diisolasi yaitu yang terikat dan membentuk kromosom dan ditemukan di nukleus, mitokondria, dan kloroplas.
6.1 Isolasi DNA
Isolasi DNA bertujuan untuk memeperoleh dan mengetahui pengaruh jenis buah dan jenis sabun terhadap kualitas DNA yang dihasilkan dalam proses isolasi. Pada percobaan ini sampel yang digunakan adalah strawberry. Prinsip dari percobaan ini adalah pemecahan membran sel dengan pemblenderan dan penambahan sabun sehingga DNA dapat dikeluarkan dari dalam sel. Sabun yang digunakan dalam percobaan ini adalah bentuk cair. Yaitu yaitu sabun cair (rinso cair).
Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel, dan presipitasi DNA. Isolasi DNA dapat dilakukan dengan beberapa cara tetapi setiap jenis tumbuhan akan memberikan hasil yang berbeda. Hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA.
Sampel strawberry memiliki kandungan air yang cukup tinggi, maka tidak digunakan banyak aquadest dalam proses pemblenderan agar DNA yang terpresipitasi bisa lebih banyak. karena semakin rendah kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin banyak, sehingga DNA yang terpresipitasi juga akan banyak.
Tahap pertama dari isolasi DNA yaitu pengeluaran DNA dari sel dengan jalan merusak dinding dan membran sel dan juga membran inti. Perusakan dapat dilakukan dengan cara mekanik atau cara kimiawi. Cara mekanik adalah dengan pemblenderan sedangkan cara kimiawi adalah dengan menambahkan senyawa kimia, misalnya sabun contohnya detergen.
Pemblenderan strawberry dan nanas bertujuan untuk merusak membran dan dinding sel sehingga DNA dapat dikeluarkan. Pemblenderan ini dilakukan dengan menambahkan sedikit aquadest yang berfungsi untuk mempermudah pemblenderan. Penambahan aquadest tidak dalam jumlah banyak karena apabila larutan terlalu encer maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Hal ini disebabkan sel yang lisis di dalam air akan lebih sedikit jika dibanding dengan larutan kental. Penambahan garam dapur pada saat pemblenderan bertujuan untuk mengendapkan DNA dimana garam akan berikatan dengan phosphat dan pada saat itulah DNA berkumpul. Penambahan garam menyebabkan protein dan karbohidrat terpresipitasi ke dalam larutan yang kemudian tersaring pada proses penyaringan. Garam dapur juga berfungsi sebagai lysing buffer yaitu menjaga pH larutan agar tetap konstan sehingga tidak terjadi denaturasi DNA. Buah nanas digunakan sebagai bahan tambahan untuk mengisolasi DNA karena buah nanas mampu memudahkan proses presipitasi DNA. Di dalam buah nanas terkandung enzim bromelin yang merupakan golongan enzim protease, dimana enzim itu mampu menghidrolisis ikatan peptida pada protein atau polipeptida menjadi molekul yang lebih kecil yaitu asam amino.
Sampel kemudian ditambah dengan larutan sabun dan dilakukan pengadukan. Penambahan sabun berfungsi untuk merusak membran sel dan membran inti sehingga DNA dapat dikeluarkan dari sel. Sabun di sini berfungsi untuk menggantikan senyawa-senyawa kimia seperti lisozim (adalah enzim yang memutuskan ikatan β-1,4-glikosida antara asam-N-asetil glukosamin dengan asam-N-asetil muramat pada peptidoglikan) yang mampu mempengaruhi kerja senyawa polimerik sehingga kekuatan sel tidak lagi dapat terjaga dan EDTA (etilendiamintetraasetat) yang berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk mempertahankan struktur selubung sel serta menghambat enzim yang dapat merusak DNA.
Sabun sendiri mengandung sodium dodesil sulfet (SDS) yang dapat menyebabkan hilangnya molekul lipid pada membran sel sehingga struktur membran akan rusak dan menglisiskan isi sel. Sabun akan merusak membran sel melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik. Sabun juga mempunyai ujung yang berbeda yaitu hidrofilik dan hidrofobik sehingga dapat membentuk ikatan. Pengadukan bertujuan untuk mempercepat proses pengrusakan membran sel, membran inti dan dinding sel oleh detergen.
Kemudian dilakukan penyaringan yang bertujuan untuk memisahkan endapan dengan filtratnya, dimana endapan ini merupakan kontaminan yang berupa tubuh sel buah tersebut. Hasil penyaringan ditambahkan dengan etanol 96% dingin yang bertujuan untuk mempermudah proses presipitasi DNA. Sehingga DNA yang telah terkumpul akan mampu terpisah dari larutan dan membentuk lapisan-lapisan yang dapat diidentifikasi unsur penyusunnya. Etanol bersifat polar sehingga dapat melarutkan DNA yang juga bersifat polar. Setelah penambahan etanol dingin larutan didiamkan dan diamati DNA yang terbentuk.
6.2 Karakterisasi DNA
Karakterisasi DNA dilakukan bertujuan untuk mengetahui sifat-sifat molekul DNA. Karakterisasi DNA dilakukan dengan pengamatan kelarutan dengan variasi pelarut yaitu aquadest, kloroform, etanol, eter, dan n-heksan. Karakterisasi juga dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer untuk memperoleh λ maksimum dan dengan pengamatan denaturasi dan renaturasi dengan penambahan asam yaitu HCl.
Pellet DNA yang terbentuk dilarutkan dalam pelarut yang berbeda yaitu aquadest, etanol, kloroform, eter, dan n-heksan yang sifat kepolarannya berbeda - beda. Dimana aquadest merupakan pelarut polar, etanol polar, eter, kloroform dan n-heksan adalah pelarut non polar. Dari percobaan ini diperoleh hasil pellet DNA larut baik dalam aquadest, dan larut tak sempurna dalam etanol, tetapi tidak larut dalam kloroform, eter, dan n-heksan. Hal ini terjadi karena DNA bersifat polar, sedangkan eter, kloroform dan n-heksan bersifat non polar, maka pelarut n-heksan, eter, dan kloroform tidak dapat melarutkan DNA, berbeda dengan aquadest yang mempunyai sifat polar makan bisa melarutkan baik DNA, untuk etanol, karena kepolaran dari DNA lebih besar dari pada etanol, maka etanol tidak dapat melarutkan DNA.
Pelarutan ini berdasarkan prinsip ”like disolve like”, dimana pelarut polar akan melarutkan zat yang bersifat polar sedangkan pelarut non polar akan melarutkan zat yang bersifat non polar.
Kemudian dilakukan pengukuran absorbansinya untuk menentukan panjang gelombang maksimumnya. Pengukuran panjang gelombang maksimum ini dilakukan dari DNA yang sudah dilarutkan dalam berbagai pelarut dan yang sudah diberi asam HCl.
Dari percobaan diperoleh hasil yaitu nilai absorbansi pada masing – masing pelarut sebelum di tambahkan HCl adalah dengan pelarut akuades 0.357 nm, etanol 0.049 nm, kloroform 0.024 nm, eter 0.022 nm dan n-heksan 0.005 nm. Sedangkan nilai absorbansi setelah penambahan HCl adalah dengan pelarut akuades 0.369 nm, etanol 0.049 nm, kloroform 0.046 nm, eter 0.047 nm dan n-heksan 0.028 nm.
Pengamatan denaturasi dan renaturasi DNA dilakukan dengan penentuan absorbansi pada panjang gelombang maximum dengan adanya penambahan asam kuat yaitu HCl. Proses denaturasi pada DNA terjadi akibat adanya penambahan asam yang dapat mengubah konformasi rantai DNA dari double helix menjadi rantai tunggal kelix. Pada percobaan ini tidak dilakukan proses renaturasi.
VII. PENUTUP
7.1 Kesimpulan
7.1.1 DNA dapat diperoleh dengan perusakan sel ekstrak dari strawberry dan nanas secara mekanik (dengan pemblenderan) dan kimiawi (dengan penambahan deterejen)
7.1.2 Dari percobaan ini diperoleh hasil pellet DNA larut baik dalam aquadest, dan larut tak sempurna dalam etanol, tetapi tidak larut dalam kloroform, eter, dan n-heksan.
7.1.3 Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang maksimum sebesar 345 nm.
7.1.4 Dari percobaan diperoleh hasil yaitu nilai absorbansi pada masing – masing pelarut sebelum di tambahkan HCl adalah dengan pelarut akuades 0.357 nm, etanol 0.049 nm, kloroform 0.024 nm, eter 0.022 nm dan n-heksan 0.005 nm. Sedangkan nilai absorbansi setelah penambahan HCl adalah dengan pelarut akuades 0.369 nm, etanol 0.049 nm, kloroform 0.046 nm, eter 0.047 nm dan n-heksan 0.028 nm.
7.2 Saran
7.2.1 Hati- hati pada saat menggunakan alat spektrofotometer
7.2.2 Teliti pada saat mengukur absorbansi
7.2.3 Teliti pada saat menimbang sampel
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2010, Deterjen, dalam http://www.chem-is-try.org/2010/sabun-dan-deterjen/
Anonim, 2012, Stroberri, dalam http: //www.plantamor.com/index.php?plant=604
Arsyad, M., 2000, “Kamus Kimia”, Erlangga, Jakarta
Basri, S., 1996, “Kamus Kimia”, P.T Rineka Cipta, Jakarta
Chandra, 2007, Nanas, dalam http://dchandra.wordpress.com/2007/11/06/nanas-buah-dengan-banyak-manfaat/
Daintith, J., 1994, “Kamus Lengkap Kimia”, Erlangga, Jakarta
Fessenden, R., 1986, “Kimia Organik”, Erlangga, Jakarta
Hartadi H., 1980, “Komposisi bahan Makanan Indonesia : data Ilmu makanan untuk Indonesia”, UGM, Yogyakarta
Hart, H., 1963, “Organic Chemistry A Short Course”, Houghton Milli and Company, Boston
Lehninger, 1982, “Dasar-Dasar Biokimia”, Erlangga, Jakarta
Mahmud, 2006, “Penentuan LC 50 48 jam detergen dan Pengaruhnya terhadap Mortakitas Larva Ikan Mas Ras Punten dengan Tipe Ploidi yang berbeda”, Jurusan Biologi FMIPA, Malang
Surya, 1989., “Genetika”, Binarupa Aksara, Jakarta
Wirahadikusumah, M., 1989, “Biokimia : Protein, Enzim dan Asam Nukleat”, ITB, Bandung
Link : Download
Tag :
Praktikum
0 Komentar untuk "PERCOBAAN VII - Isolasi DNA ( Praktikum Biokimia )"